Ang genomic sequence ng karamihan sa mga virus ay kilala.Nucleic acid probe na maiikling mga segment ng DNA na idinisenyo upang mag-hybrid sa mga pantulong na viral DNA o RNA segment.Ang polymerase chain reaction (PCR) ay isang mas mahusay na pamamaraan para sa viral detection.Ang mga pamamaraan ng diagnostic na high throughput ay binuo kamakailan.
A. Nucleic acid hybridization technique
Ang hybridization ng nucleic acid, pangunahin kasama ang Southern blotting(Southern) at Northern blotting(Northern), ay isang mabilis na pagbuo ng bagong pamamaraan sa larangan ng diagnostic ng virus.Ang katwiran ng hybridization assay ay ang paggamit ng mga maikling segment ng DNA (tinatawag na "probe") na idinisenyo upang mag-hybrid sa mga pantulong na viral DNA o RNA na mga segment.Sa pamamagitan ng pag-init o alkaline na paggamot, ang double-stranded na target na DNA o RNA ay pinaghihiwalay sa mga solong hibla at pagkatapos ay hindi kumikilos sa isang solidong suporta.Pagkatapos nito, ang probe ay idinagdag at na-hybrid sa target na DNA o RNA.Dahil ang probe ay may label na isotope o non-radioactive nuclide, ang target na DNA o RNA ay maaaring makita sa pamamagitan ng autoradiography o ng biotin-avidin system .Dahil ang karamihan sa mga viral genome ay na-clone at na-sequence, maaari silang ma-detect gamit ang mga sequence na partikular sa virus bilang mga probe sa specimen.Sa kasalukuyan, ang mga paraan ng hybridization ay kinabibilangan ng: dot blot , in situ hybridization sa mga cell , DNA blotting(DNA) (Southern blot) at RNA blotting(RNA) (Northern blot).
B.PCR Technology
Sa nakalipas na mga taon, isang serye ng mga in vitro nucleic acid amplification techniques ang binuo batay sa PCR, upang subukan ang mga insensitive o uncultivable na mga virus.Ang PCR ay isang paraan na maaaring mag-synthesis ng tiyak na pagkakasunud-sunod ng DNA sa pamamagitan ng in vitro polymerase reaction.Kasama sa proseso ng PCR ang thermal cycle ng tatlong hakbang: denaturation , annealing , at extension Sa mataas na temperatura (93 ℃~95 ℃), ang double-stranded na DNA ay pinaghihiwalay sa dalawang solong DNA strand;pagkatapos ay sa mababang temperatura (37 ℃ ~ 60 ℃), dalawang synthesized nucleotide primers anneal sa komplementaryong mga segment ng DNA;samantalang sa naaangkop na temperatura para sa Taq enzyme (72 ℃), ang synthesis ng mga bagong DNA chain ay nagsisimula mula sa primer 3'end gamit ang komplementaryong DNA bilang mga template at nag-iisang nucleotides bilang mga materyales.Kaya pagkatapos ng bawat cycle, ang isang DNA chain ay maaaring palakihin sa dalawang chain.Sa pag-uulit ng prosesong ito, ang bawat DNA chain na na-synthesize sa isang cycle ay maaaring gamitin bilang template sa susunod na cycle, at ang bilang ng mga DNA chain ay nadodoble sa bawat cycle, na nangangahulugang ang produksyon ng PCR ay pinalaki sa isang 2n log speed.Pagkatapos ng 25 hanggang 30 cycle, ang produksyon ng PCR ay nakikilala sa pamamagitan ng electrophoresis , at ang mga partikular na produkto ng DNA ay maaaring maobserbahan sa ilalim ng UV light (254nm).Para sa kalamangan nito sa pagiging tiyak, sensitivity, at kaginhawahan, ang PCR ay pinagtibay sa klinikal na pagsusuri ng maraming mga impeksyon sa viral gaya ng HCV, HIV, CMV, at HPV.Dahil ang PCR ay napakasensitibo, maaari itong makakita ng virus DNA sa antas ng fg, ang operasyon ay dapat na maingat na isagawa upang maiwasan ang maling positibo.Bilang karagdagan, ang positibong resulta sa pagsusuri ng nucleic acid ay hindi nangangahulugang mayroong live na nakakahawang virus sa sample.
Sa malawak na aplikasyon ng PCR technique, ang mga bagong pamamaraan at pamamaraan ay binuo batay sa PCR technique para sa iba't ibang layunin ng pagsubok.Halimbawa, ang real time quantitative PCR ay maaaring makakita ng viral load;in situ PCR ay ginagamit upang makilala ang impeksyon ng virus sa tissue o mga cell;Maaaring pataasin ng nested PCR ang specificity ng PCR.Kabilang sa mga ito, ang real time quantitative PCR ay mas mabilis na nabuo.Maraming mga bagong diskarte, tulad ng TaqMan hydrolysis probe, hybridization probe, at molecular beacon probe, ay pinagsama sa real time quantitative PCR technique, na malawakang ginagamit sa klinikal na pananaliksik.Bukod sa tumpak na pagtukoy sa viral load sa likido sa katawan ng mga pasyente, ang pamamaraang ito ay maaari ding gamitin upang makita ang drug-tolerant mutant.Samakatuwid, ang real time quantitative PCR ay pangunahing inilalapat sa pagsusuri ng epekto ng paggamot at pagsubaybay sa pagpapaubaya sa droga.
C. High-throughput detection ng mga viral nucleic acid
Upang matugunan ang mga pangangailangan para sa mabilis na pagsusuri ng mga bagong umuusbong na nakakahawang sakit, iba't ibang paraan ng high-throughput detection, tulad ng DNA chips(DNA), ay itinatag.Para sa mga DNA chip, ang mga partikular na probe ay synthesize at ikinakabit sa maliliit na silicon chips sa napakataas na density upang bumuo ng DNA probe microarray (DNA) na maaaring i-hybrid sa sample.Ang signal ng hybridization ay maaaring ilarawan sa pamamagitan ng confocal microscope o laser scanner at mas maproseso ng computer at ang malaking set ng data tungkol sa iba't ibang mga gene ay maaaring makuha.Mayroong dalawang uri ng DNA chip.Ang "synthesis chip" ay ang mga sumusunod: ang partikular na oligonucleotides ay direktang na-synthesize sa mga chips.Ang isa pa ay ang DNA pool chip.Ang mga naka-clone na gene o mga produkto ng PCR ay maayos na naka-print sa slide.Ang bentahe ng teknolohiya ng DNA chip ay ang sabay-sabay na pagtuklas ng isang malaking dami ng mga sequence ng DNA.Ang pinakabagong bersyon ng pathogen detection chip ay maaaring makilala ang higit sa 1700 mga virus ng tao nang sabay-sabay.Nalutas ng teknolohiya ng DNA chip ang mga problema ng tradisyonal na mga pamamaraan ng hybridization ng nucleic acid at may napakalawak na aplikasyon sa viral diagnosis at epidemiological na pag-aaral.
Oras ng post: Dis-23-2020